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归芪补血精对小鼠粒巨系祖细胞的体外增殖作用

字号:  小  中  大  | 打印 发布: 2008-6-30 07:47    作者: 尹荣焕， 许海涛， 程辑鑫    来源: 中国兽医杂志   

 

    沈阳农业大学畜牧兽医学院， 辽宁 沈阳 110161

 

    归芪补血精是依据中兽医“气血”理论，以黄芪行气、当归养血，再配以抗氧化作用较好的何首乌、绞股蓝等中药研制而成，属于抗氧化和补血作用二者合一的一种复方制剂，在兽医临床上用于鹿缺硒引起的贫血疗效显著。关于该方的抗氧化及其作用机理曾有报道，但关于

其抗贫血作用机理尚未明确。本文采用造血祖细胞体外培养技术，就归芪补血精对粒巨系祖细胞（CFUGM）体外增殖的影响进行了研究，以探讨其抗贫血作用机理。

1具材料与方法

1.1 材料 

1.1.1 动物 健康昆明系小鼠72只，雌雄皆用，体重20±2 g。

1.1.2 药品及试剂 归芪补血精配方：当归Angelica sinensis (Oliv) Diels、黄芪

Astragalus mongholicus Bge. var. mongholicus (Bge) Hsiao、何首乌Polygonum multiflorum Thunb、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch、丹参Salvia miltiorrhiza Bge.与绞股蓝Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Mak.各等量组成。中药材除黄芪购自于内蒙古呼和浩特医药公司外，其余药物均购自吉林省药材公司，按文献鉴定真伪及质量，根据文献所载炮制方法制成散剂； CHROMA牌印度墨汁，64 mg碳粒/ml；马血清  由Gibco公司提供；Agar日本进口分装；淋巴细胞分层液（1.077 g/ml）由鼎国公司提供；RPMI 1640培养基由Gibco公司提供。

1.1.3 主要仪器 MCO17AⅠ型CO2培养箱，日本SANYO公司；XDS1B倒置生物显微镜，重庆光电仪器总公司；CELLDYN 1400型血球计数仪  产地美国。

1.2 实验动物贫血模型的建立  将小鼠先以常备饲料饲喂3天，第4天开始实验动物眼球采血0.5 ml/只，EDTA2K抗凝，检测血液RBC、Hb值，于放血24 h后重复测定上述指标，第2次测定值与前次比较差异极显著（P＜0.01），表示模型复制成功。正式试验开始，将小鼠按表

1随机分成6组，10天后检测。

表1 实验动物分组处理

组别           动物只数       饲料

空白对照         12         基础日粮

1% GQBXJ         12       基础日粮+1% 归芪补血精

3% GQBXJ         12       基础日粮+3% 归芪补血精

5% GQBXJ         12       基础日粮+5% 归芪补血精

10% GQBXJ        12       基础日粮+10% 归芪补血精

补Fe对照        12        基础日粮+24 mg/kg FeSO4

1.3 血液WBC的检测 小鼠尾尖采血，用血球计数仪检测。

1.4 造血祖细胞(CFUGM)的体外增殖试验

1.4.1 骨骼肌条件培养液（SMCM）的制备 颈椎脱位处死小鼠，无菌取前后肢肌肉组织，用眼科剪剪成约3 mm大小的小块，将剪后的肌组织在RPMI1640培养液内浸泡2 h，将7 ml RPMI1640培养液（含双抗），2 ml马血清及浸泡后的肌组织块1 g（湿重）加入30 ml培养瓶内，用胶塞封口放入普通37℃恒温箱中培养，7天后用吸管吸出清亮淡黄色上清液移入500 ml大瓶内，混匀后分装，-20℃冰箱保存。

1.4.2 骨髓单个核细胞（BMMNCS）的制备与纯化 颈椎脱位处死小鼠，无菌分离股骨，用RPMI 1640培养液冲出全部骨髓，轻轻吹打骨髓细胞悬液，过7号和4号针头，800 r/min离心10 min；沉淀细胞用培养液混匀至4 ml后，加入装有2 ml淋巴细胞分离液的细口径试管中（骨髓细胞悬液∶分离液=2∶1），两液面要保持清晰的界面，1 500 r/min离心25 min；取中间絮状有核细胞层放于另一试管中，用毛细吸管轻轻吹打混匀，800 r/min离心10 min，倾去上清液，再用培养液洗涤细胞2次，制成细胞悬液，浓度为2×105个/ml。

1.4.3 骨髓有核细胞活力的检测 将1滴细胞悬液与2滴2%台盼蓝染液混合后，滴入细胞计数板。2 min后在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞的百分比，大于95%就可以进行培养。

1.4.4 CFUGM体外培养培养体系总体积7.6 ml（含双抗的RPMI 1640培养液3.5 ml、细胞悬液0.4 ml、马血清2.5 ml、肌条件培养液0.8 ml、印度墨汁0.1 ml、琼脂0.4 ml），加入35 mm培养皿中，每皿1 ml，加盖送入37℃、饱和湿度的5%的CO2培养箱中培养7天，以多于50个细胞的克隆单位为一个集落，在4×10倍生物显微镜下计数全皿集落数（每个集落表示来源一个祖细胞）。

2 结果 

2.1 对贫血小鼠WBC的影响 各中药组小鼠的WBC数量较空白对照组均有不同程度的提高，见表2。其中3%、5%和10%中药剂量组与空白对照组比较，差异显著（P＜0.05），且与阳性对照组比较差异不显著（P＞0.05）；1%中药剂量组与空白对照组比较差异不显著（P＞0.05）。

2.2 对CFUGM体外增殖的影响各试验组与对照组所形成的CFUGM细胞集落数见表2。由下表可知，4个不同浓度中药组所生成的CFUGM细胞集落数较空白对照组分别提高了33.8%、49.9%、57.3%、48.9%（P<0.05），且与补Fe对照组差异不显著（P>0.05），其中以5%浓度时升高最明显，达到125.50±13.48，高于补Fe对照组。说明该方剂能够促进贫血小鼠粒巨系祖细胞的生成。

表2 中药对小鼠血液WBC、RBC、HGB、RC的影响

组  别      空白对照     1% GQBXJ     3% GQBXJ       5% GQBXJ     10% GQBXJ      补Fe对照

WBC(109/L) 8.00±0.89   8.28±0.93   9.90±2.51   11.20±1.63    9.74±1.27     10.88±1.29

注：与空白对照组比较差异显著，P<0.05

表3 CFU-GM生长情况

组  别         空白对照  1% GQBXJ   3% GQBXJ  5% GQBXJ  10% GQBXJ     补Fe对照

集落数(个/皿)79.80±7.55 106.75±12.66 119.60±12.42 125.50±13.48 116.73±16.23 118.80±12.73

注：与空白对照组比较差异显著，P<0.05

3 讨论 

现在一般认为，在造血组织中存在一类能够生成各种血细胞的最原始的细胞，也就是全能造血干细胞（THSC）。THSC在一定的造血微环境和某些因素的诱导下可增殖分化为多能淋巴干细胞和多能髓性造血干细胞（PMSC或CFUS），CFUGM就是由后者分化而来并可进一步发育成白细胞和巨噬细胞。造血的过程其实就是造血干细胞祖细胞增殖分化形成血细胞的动态平衡的过程。而药物可通过影响造血干细胞、祖细胞的增殖分化等多种环节影响造血过程。因此，造血祖细胞体外培养技术为我们探讨药物的作用提供了手段和方法。

    CFUGM属于晚期造血祖细胞，是失去自我更新能力的过渡性增殖性细胞群体。它在体外增殖分化时，除了必需的培养液、血清、合适的温度与酸碱度等条件外，还必须在其特异的集落刺激因子（GMCSF）的作用下，才能产生嗜中性粒细胞和巨噬细胞，而形成相应的集落。我们选择应用较广的肌条件培养液。以往研究已证实，肌条件培养液中含有GMCSF、GCSF、M-CSF。

    在本试验研究结果中，不同浓度的用药组对CFUGM增殖速率明显高于空白对照组，表明该方剂已经启动了造血祖细胞，使其加速了增殖和分化，从而促进造血功能的恢复。由于CFU-GM来源于全能造血干细胞，因此我们认为，归芪补血精的补血机制是活化了最原始的全能造血干细胞，刺激其分化。由于CFUGM发育的终末细胞是白细胞和巨噬细胞，二者均参与机体免疫，提示该方剂可以提高机体免疫力。

综上试验结果，归芪补血精有助于失血小鼠贫血的恢复，在体外培养中，药物作用组骨髓粒巨系祖细胞的增殖速率均明显增加，并与临床外周血细胞的加速回升基本一致。说明该方剂具有良好的抗贫血作用，其抗贫血的机理是启动了部分造血祖细胞。这也为该方的推广使用提供了理论依据。

 



TAG: 祖细胞 小鼠 增殖 补血
 

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