华南农业大学兽医学院， 广东 广州 510642
摘要： 用单卵囊分离法获得的鸡的3种艾美耳球虫（每种各2株）卵囊：柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)。经纯化、提取基因组DNA后，用报道的种特异引物做PCR扩增分析，以确定是否为纯种。结果发现这3种球虫均存在混合感染的情况。该结果为进一步研究这3种球虫奠定了基础，并说明特异PCR方法能够有效地、快速地鉴别球虫虫种。
关键词： 鉴别； 艾美耳球虫； 特异PCR； 鸡
鸡的球虫病是养鸡场最常见的、也是最为严重的一种疾病，表现为肠道广泛的、严重的病变，肠黏scau.edu.cn膜吸收功能下降导致体重减轻、腹泻、饲料转化率降低以及死亡率升高等。目前认为鸡主要有7种艾美耳球虫：堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫。所有种的球虫均有一定的致病性，自然感染时常表现为两种以上球虫混合感染。常规的鉴别诊断主要根据卵囊的形态、肠道病变、寄生部位、最短孢子化时间和潜伏期，但是结果并不十分可靠。然而对鸡艾美耳球虫虫种的分离和鉴别，是调查某地区内球虫种类和获得球虫纯种体系的重要手段，对进一步研究球虫的致病性、药物效应、耐药性、免疫性及临床疫苗的应用等具有极其重要的意义。因此，充分利用现有研究成果，将近几年发展起来的分子鉴别与诊断技术与常规技术相结合对球虫虫种进行确诊是十分必要的。最近发展的基于DNA的诊断试验使球虫鉴别变得快速和便利。本项研究利用S.Fernandez等（2003）报道的种特异引物对3种艾美耳球虫（柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫）进行基因组DNA的鉴别，以确定是否为纯种，为进一步研究该3种球虫的分子遗传特征奠定基础。
1 材料与方法
1.1 球虫虫种 试验球虫由本教研室传代保存，它们是柔嫩艾美耳球虫早熟株、柔嫩艾美耳球虫强毒株、巨型艾美耳球虫早熟株、巨型艾美耳球虫强毒株、堆型艾美耳球虫早熟株、堆型艾美耳球虫强毒株，均用球虫单卵囊分离法将单卵囊接种在无球虫环境下饲养的5～6日龄鸡获得，经完全孢子化后，于2.5%（w/v）重铬酸钾保存。
1.2 主要试剂 蛋白酶K为Merck公司产品，Wizard DNA Cleanup System为Promega公司产品，PCR试剂（rTaq酶、10×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs等）、DL2000为大连宝生物公司产品，玻璃珠（8号）为Sigma公司产品，琼脂糖为上海Yito有限公司产品。
1.3 球虫卵囊的纯化 将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液，以2 000×g离心10 min，弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊20 min，2 000×g离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1 500×g离心10 min，上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水，3 000×g离心10 min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在
1.4 球虫基因组DNA的提取 将纯化好的虫卵3 000 r/min离心10 min，去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有95％卵囊破壁后，即可用于消化。 消化时，加入300 μl消化液，其中NaCl 500 mmol 60 μl；TrisHCl(pH=8.0) 100 mmol 30μl；EDTA(pH=8.0) 50 mmol 150 μl；10% SDS 30 μl；Proteinase K 25 mg/ml 30 μl。置于
Cleanup System 提取基因组DNA（gDNA），于
1.5 特异PCR扩增
根据S.Fernandez等（2003）的报道，柔嫩艾美耳球虫的特异引物为Tn01-F和Tn01-R，巨型艾美耳球虫的特异引物为Mx 01-F和Mx01-R，堆型艾美耳球虫的特异引物为A
c01F和Ac01R，它们的序列如下：
Tn01F：5′CCG CCC AAA CCA GGT GTC ACG3′
Tn01R：5′CCG CCC AAA CAT GCA AGA TGG C3′
Mx01F：5′GGG TAA CGC CAA CTG CCG GGT ATG3′
Mx01R：5′AGC AAA CCG TAA AGG CCG AAG TCC TAG A3′
Ac01F：5′AGT CAG CCA CAC AAT AAT GGC AAA CAT G3′
Ac01R：5′AGT CAG CCA CAG CGA AAG ACG TAT GTG3′
以上引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。预期扩增片段大小为：811bp、539bp和
272bp。扩增体系为：10×PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μl、MgCl2（25 μmol）
2.5 μl（Ac01为3.5 μl）、dNTP Mixture（2.5 μmol each）2 μl、引物（50 pmol/μl）0.275 μl（Ac01为0.35 μl）、rTaq（5 U/μl）0.25 μl、模板（gDNA）1 μl，最后加ddH2O到25 μl。Tn01和Mx01反应条件为：
2 结果
2.1 柔嫩艾美耳球虫种特异引物PCR扩增结果 用特异引物Tn01扩增6株球虫的基因组DNA，结果显示2个柔嫩艾美耳球虫株都扩增出了目的条带，大小约530bp左右，并且没有非特异性条带。但是巨型强毒株和2个堆型艾美耳球虫株的也出现了亮度不一致，但与柔嫩艾美耳球虫大小一致的条带，说明它们的DNA污染了柔嫩艾美耳球虫的DNA（图1）。〖JP〗
2.2 巨型艾美耳球虫种特异引物PCR扩增结果 用特异引物Mx01扩增6株球虫的基因组DNA，结果显示2个巨型艾美耳球虫株都扩增出了目的条带，270bp左右。而且柔嫩强毒株和2个堆型艾美耳球虫株也出现了亮度不一致且与巨型艾美耳球虫大小一致的条带，说明它们的DNA污染了巨型艾美耳球虫的DNA。
2.3 堆型艾美耳球虫种特异引物PCR扩增结果 用特异引物Ac01扩增6株球虫的基因组DNA，结果显示2个堆型艾美耳球虫株都扩增出了目的条带，810 bp左右，并且没有非特异性条带。而且柔嫩强毒株也出现了与堆型艾美耳球虫大小一致的条带，说明它的DNA污染了堆型艾美耳球虫的DNA。
3 讨论
本项研究用特异引物Tn01、Mx01和Ac01分别扩增柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫共3种6株的基因组DNA，结果发现均能相应地扩增出条带清晰的目的条带，说明这3种特异引物特异性好；而且扩增过程中，也有效地鉴定出污染虫株，如：柔嫩强毒株污染了巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫，巨型强毒株污染了柔嫩艾美耳球虫，2株堆型艾美耳球虫都污染了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫。该试验有效地鉴定出这6株球虫中柔嫩早熟株和巨型早熟株为纯种，其他4株均为混合虫株，说明特异PCR方法能够有效地、快速地鉴别球虫虫种；而且避免了因试验球虫种株不纯而盲目试验所造成的试验虫株DNA的浪费，节省了人力物力财力，并为进一步研究该3种球虫的分子遗传特征提供有效保障。
应该说用单卵囊分离法获得球虫纯种还是比较可靠的［7］，但是本项研究结果却出现了混合感染株，这可能是在球虫分离过程中污染了其他球虫株或是在以后的操作过程中不慎污染了其他球虫株。这一事实充分说明了球虫在分离纯化过程中极易互相污染，想获得球虫纯种有一定的难度，这需要对试验场地及用具彻底消毒和试验员细心谨慎的操作才可避免。另外，在养殖实践中，鸡场内球虫无处不在，而且不止一个种球虫，常常不能彻底消毒，因此感染鸡体内常有多种球虫同时混合感染；用本项研究所建立的特异PCR方法对这些混合感染的球虫种类进行鉴定具有一定的实用价值。
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