绵羊及其环境中肠球菌生态分布的调查研究

 

        

    摘　要：对新疆生产建设兵团农五师84团与90团、农八师新业羊场及142团羊场健康绵羊的鼻拭、肛拭、青贮饲料、棉籽壳、饮水以及周围环境中的土壤进行检测。共检测220个样本，分离得到47株革兰氏阳性、成双或链状排列的球菌；经培养特性、生化特性鉴定，并针对肠球菌高保守的特异性tuf基因，设计的特异性引物对这47株分离株进行PCR扩增，对扩增产物进行分析。结果有4株为非肠球菌，其余43株均为肠球菌。结果表明羊体及其周围环境中肠球菌分布率达19.5%。

 

    关键词：环境；肠球菌；分布；绵羊 

 

    肠球菌(Enterococcus)属于链球菌科肠球菌属的圆形或椭圆形、呈双或成链状排列的革兰氏阳性球菌。既往认为肠球菌是对人类无害的共栖菌，但近年已证实了肠球菌的致病力，美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二大病原菌[1­3]。到目前为止，正式命名的肠球菌共有16个种，分属在5个群，其中对人类致病的主要为粪肠球菌和屎肠球菌，少数为其他肠球菌。

 

    肠球菌不仅可引起尿路感染和皮肤软组织、外科伤口、烧伤创面感染，还可引起危及生命的腹腔感染、败血症、心内膜炎和脑膜炎等[4­5]。国外也有资料表明在许多动物以及动物性食品中可分离出肠球菌，且为多重耐药肠球菌，并且屎肠球菌的感染率也不断上升[6]；肠球菌广泛分布在自然界中，在土壤、粪便、水源、污水中均能分离出肠球菌，且分离出的肠球菌有很高的变种，每个分离株都有其各自的耐药基因型[7]。由于肠球菌具有天然耐药和获得性耐药的特征，使所致感染治疗困难。因此，对动物源性肠球菌要做到防患于未然，分布在自然界中的肠球菌也不容忽视。我国仅有关于机会感染的病例报道，以及肠球菌生物学特性的研究，并且只从病死动物体内分离得到肠球菌，很少对肠球菌的生态学分布进行研究与探讨。

 

    本研究采用常规的培养特性鉴定和生化特性鉴定以及分子生物学鉴定，对羊体及其周围环境中肠球菌的分布进行检测，为进一步研究肠球菌的生态学分布打下基础，也为对该病的预防和治疗提供参考材料。

 

        1　材料与方法

 

        1.1　样本、对照菌株来源

 

    样本分别来自于新疆生产建设兵团农五师84团与90团、农八师新业羊场及142团羊场健康绵羊的鼻拭、肛拭、青贮饲料、棉籽壳、饮水以及周围环境中的土壤，共220个样本。

 

    对照菌株，肠球菌致病菌株、大肠埃希菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌C、化脓链球菌A、化脓链球菌G均由本试验室提供。

 

       1.2　方法

 

1.2.1　采样　采用无菌棉拭采集羊体的鼻腔分泌物、肛门内容物，并采集其新鲜粪便、青贮饲料、棉籽、饮水以及周围环境中的土壤，分装于灭菌试管中。

 

1.2.2　分离、培养及纯化　无菌取鼻拭液、肛拭液、水样、粪便、青贮饲料、棉籽壳及土壤，经生理盐水浸泡30 min后的上清液各50 μL，接种于链球菌增菌肉汤培养18 h～24 h，并划线接种于叠氮钠血液琼脂平板和链球菌选择性琼脂平板上，放置于37 ℃恒温培养箱培养18 h～24 h，观察生长情况。涂片、染色、镜检，挑取单个可疑菌落，接种于LB血平板上进行纯化。

 

1.2.3　分离菌株形态学观察　取纯培养物分别接种于各个不同培养基上，观察其菌落形态；并涂片、染色、镜检，观察其菌体形态。

 

1.2.4　分离株鉴定

 

1.2.4.1　培养特性鉴定　取纯培养物划线接种于LB血液琼脂平板，分别置于37 ℃恒温培养箱和体积分数为10%的CO2培养箱中24 h～48 h，观察其对氧的需求程度；划线接种于血液琼脂平板，分别置于45 ℃和10 ℃的培养箱中24 h～48 h，观察其对温度的耐受性；分别接种于65 g/L NaCl和pH 9.6的LB肉汤，置37 ℃恒温培养箱中24 h～48 h，观察其对高盐和高碱的耐受性，并记录结果。

 

1.2.4.2　生化特性鉴定　取纯培养物接种于葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、山梨糖、甘露糖、菊糖、棉子糖、海藻糖、水杨素、马尿酸钠、MR、VP、氯化钠­胆汁七叶苷、H2O2等生化试剂，37 ℃培养24 h，观察并记录结果。

 

1.2.5　分离菌株的PCR快速鉴定　分离菌株DNA的提取参照文献[8]，并针对肠球菌属的高度保守的tuf基因[9]片段设计特异性引物(Ent1，Ent2)，鉴定分离株的属别。

 

1.2.5.1　引物　上游引物Ent1：5′­TAC TGA CAA ACC ATT CAT GAT G­3′；下游引物Ent2：5′­AAC TTC GTC ACC AAC GCG AAC­3′。

 

其扩增片段长度为112 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

 

1.2.5.2　PCR反映体系及扩增条件　10×buffer(Mg2＋ Free) 2 μL；MgCl2(25 mmol/L) 1.2 μL，DNA模板0.5 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.3 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 0.5 μL，上下游引物(25 mmol/L)各0.2 μL，双蒸水补足20 μL。反应条件： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30s,55 ℃ 30 s,72℃30 s,30个循环；72 ℃ 10 min，于4 ℃结束反应。

 

1.2.5.3　PCR产物鉴定　PCR扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 μg/mL)上以溴酚蓝作指示剂于1×TBE中200 V电压电泳30 min，在凝胶成像系统中观察扩增产物，以PCR产物出现112  bp条带的分离株为肠球菌。

 

2　结果

 

2.1　分离菌株的形态特征

 

将纯培养物进行革兰氏染色，均可见呈双或链状排列的菌体，液体培养物均以长链为主，革兰氏阳性，有时老龄培养物会出现阴性。在LB血平板上多形成无色、透明、圆形、湿润、光滑、边缘整齐、中等大小菌落；在链球菌选择琼脂培养基上均形成紫红色、圆形湿润、表面光滑、边缘整齐、针尖大的菌落；在叠氮钠血液琼脂培养基上形成灰白色、中央凸起、边缘透明整齐的圆形菌落。

 

2.2　分离菌株的培养特性

 

各分离菌株均为兼性厌氧菌，均在45 ℃和10 ℃的温度条件下生长；在体积分数为10%的CO2及37 ℃有氧条件下生长良好，且在高盐(65 g/L NaCl)、高碱(pH 9.6)、低盐(20 g/L NaCl)均可生长，表明所有分离菌株均对高温、低温、高盐、高碱具有很强的耐受性，符合肠球菌属的生物学特性，也是肠球菌属与同科的链球菌属细菌最大的区别。

 

2.3　分离菌株的生化特性

 

分离菌株的生化试验结果见表1。 

 

表1　43株肠球菌分离株生化反应鉴定结果

 

2.4　分离菌株PCR反应结果

 

通过对分离菌株进行PCR扩增，均得到约为112 bp的特异性条带，部分PCR结果见图1；而在相同条件下大肠埃希菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌、化脓链球菌，双蒸水等均扩增不出此特异性条带，结果见图2。 

 

 

 

M.DNA标准DL 2 000；1～4.84团部分分离株tuf基因PCR结果；5～7.90团部分分离株tuf基因PCR结果；8～11.142团部分分离株tuf基因PCR结果；12～15.新业羊场部分分离株tuf基因PCR结果

 

M.DNA Marker DL 2 000；1­4.PCR products of  84 Farm isolates；5­7. PCR products of 90 Farm isolates；8­11.PCR products of 142 Farm isolates；12­15.PCR products of Xin Ye sheep farm isolates

 

图1　分离株tuf基因PCR结果

 

Fig.1　PCR products of tuf gene of  isolates

 

 

 

M.DNA标准DL 2 000；1～7.大肠埃希菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、马腺疫链球菌C、化脓链球菌A、化脓链球菌G、双蒸水PCR结果；8.肠球菌PCR结果

 

M.DNA Marker DL 2 000；1­7.PCR products of E.coli， Listeriasis， S.aureus， S.equi C， S.pyogenes A， S.pyogenes G， ddH2O；8： PCR products of Enterococcus

 

图2　tuf基因PCR特异性

 

Fig.2　Specificity analysis of tuf  gene 

 

3　讨论

 

从采集的220个样中共分离出43株肠球菌，其中从健康绵羊鼻拭85个样中分离出13株，带菌率为15.3%；肛拭85个样中分离出14株，带菌率为16.5%；粪便15个样中分离出6株，带菌率为40.0%；青贮饲料12个样中分离出2株，带菌率为16.7%；水源10<SPAN style="FONT-FAMILY: 宋体; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'; mso-ascii-font-fa