兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所， 甘肃 兰州 730000
摘要：本文报道了金丝桃素体外抗口蹄疫病毒（FMDV）的研究结果。采用双抗体捕获抗原法、病毒滴度测定、MTT法、组织细胞培养等方法均检测到抗病毒作用。结果显示：金丝桃素在BHK-21细胞感染FMDV前、后及同时加入，都有明显抑制细胞病变的作用。金丝桃素使FMDV的TCID-50从8.5下降到6.25。双抗体捕获抗原法检测到金丝桃素有效抑制FMDV和BHK21细胞的吸附、融合，抑制率可达59.72%。研究结果提示：金丝桃素在体外有抗口蹄疫病毒作用，抑制口蹄疫病毒与宿主细胞的吸附、融合是抗病毒的
重要途径之一。
关键词：金丝桃素； 抗口蹄疫病毒； BHK-21细胞； 细胞病变
金丝桃素(hypericin,HY)是从贯叶连翘（Hypericun perforratum L）中提取的，为一种有光敏活性的萘骈二蒽酮化合物。临床应用证明，金丝桃素有愈伤、利尿、止血、消肿，治疗神经衰弱和解除精神痛苦，抗抑郁症等作用。近年来其抗肿瘤和抗病毒的研究比较活跃，已试用于艾滋病的治疗。对包膜病毒引起的急慢性感染具有较好的疗效，常用于肝炎病毒、单纯疱疹病毒、水痘病毒和巨细胞病毒感染。在细胞培养具有抗逆转录病毒的作用。但国内有关金丝桃素抗病毒方面的报道较少。该药已通过我国国家参考实验室对禽流感病毒H5N1和H9N2的体外实验，采用KleinDefors悬浮杀灭与感染试验方法，结果表明：金丝桃素每毫升含0.3 mg生药的浓度时与禽流感病毒作用30 min，对病毒的杀灭率可达100%，有较好的杀病毒作用。为了进一步考察对其他病毒的活性，进行了金丝桃素抗口蹄疫病毒的研究，探讨其抗口蹄疫病毒的作用机理，从而对研制新型抗病毒药物提供理论依据。
1 材料与方法
1.1病毒株和宿主细胞O型口蹄疫OS/99病毒株经BHK-21细胞增殖传代，由中牧股份兰州生物药厂提供。BHK-21细胞来自中国兽医药品监察所，经常规传代培养。
1.2 药物 金丝桃素由中国农科院兰州畜牧与兽药研究所从贯叶连翘中提取、分离、纯化而来（用HPLC测金丝桃素含量达到药物的相关规定）。溶于二甲基亚砜（DMSO），原液浓度为100 mg/ml，拉米夫定（每片含100 mg拉米夫定），国药准字H20030581，莪术油（ZTO）含有莪术油0.4 mg/ml葡萄糖注射液，国药准字H20013161；药物用细胞维持液稀释所需浓度。
1.3 对BHK-21细胞的毒性试验 通过细胞形态学观察，了解药物引起的细胞毒性作用。根据Mosmann等建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应，不能使细胞产生CPE的药物最大浓度视为最大无毒剂量。
1.4 体外抗病毒试验 BHK-21细胞按常规方法进行培养。正常细胞对照组加维持液，药物对照组：莪术油；拉米夫定。用药组为金丝桃素,每组分四个浓度，采用96孔细胞培养板，每一浓度加8孔，试验以三种方式进行：Ⅰ药物对FMDV的直接灭活作用：病毒悬液与含药培养液在充氧
1.5 病毒滴度测定 将含107个TCID-50的FMDV接入铺满单层的BHK-21细胞，然后加入不同浓度的金丝桃素、莪术油、拉米夫定。置
1.6 双抗体捕获抗原法检测抗原试验以如下方式进行：1组药物对FMDV的预防作用。将不同浓度药物与BHK-21细胞，在
1.7 统计学方法 数据以±S表示，检测结果采用SPSS统计软件进行oneway ANOVA分析。P＜0.05为差异显著。
2 结果
2.1 细胞毒性 拉米夫定在16 mg/ml，莪术油葡萄糖在1∶8以上稀释（0.05 mg/ml）金丝桃素在10 mg/ml浓度范围内对BHK-21细胞均无毒性作用。
2.2 体外抗FMDV试验 金丝桃素莪术油、拉米夫定、在无毒性浓度范围内都具有一定抗FMDV作用（表1）。金丝桃素能有效抑制FMDV所致的CPE（图1），在较低浓度抗FMDV作用呈浓度依赖性，随着药物浓度升高抗病毒作用呈上升趋势，当抗病毒作用达最大浓度，药物抗病毒作用呈现阈值现象，随药物浓度的升高，抗病毒作用无明显变化。
2.3 抗FMDV病毒作用环节探讨 在镜下观察CPE基础上，MTT染色细胞，测定吸光度，以便进一步客观地反映药物的作用效果。Ⅰ组：观察药物对病毒的直接灭活作用。在浓度大于0.02 mg/ml，金丝桃素已表现出对FMDV的直接灭活作用。Ⅱ组：试验目的是观察药物能否进入细胞或吸附于细胞表面，以阻止病毒的吸附与穿入。结果表明金丝桃素浓度在大于0.02 mg/ml时，对FMDV有作用，0.03 mg/ml时抗病毒作用最显著。Ⅲ组：试验目的是观察药物能否对已进入细胞内的病毒有抑制其生物合成及成熟、释放作用。结果表明金丝桃素在0.02 mg/ml时对FMDV有作用。综上，说明金丝桃素无论是药物与细胞作用1 h感染FMDV，或是药物与病毒作用1 h后加入细胞层及FMDV先吸附细胞1 h后加入药物，均具有抗病毒作用(表2)。
表1 金丝桃素、莪术油、拉米夫定抗FMDV致CPE的影响
分组 药物剂量 每孔CPE程度
金丝桃素 0.01 ++
（mg/ml） 0.02 +
0.03 -
0.05 +
莪术油 0.01 +++
（mg/ml） 0.02 ++
0.03 -
0.05 -
拉米夫定 0.5 +
（mg/ml） 1 -
3 -
5 -
正常对照 0 -
病毒对照 0 ++++
注：-无细胞病变；+1/4以下的细胞病变；++1/4-1/2的细胞有病变；+++1/2-3/4的细胞病变；++++3/4以上的细胞有病变。（下表2.3同）。
