（1.四川农业大学动科院动物预防医学生物工程实验室，四川雅安 625014；2.四川大学生命科学学院，四川大学“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台，四川成都 610064）
摘 要：DNA疫苗作为第三代全新的疫苗，具有传统疫苗和其他基因工程苗不可比拟的优点。但由于其安全性方面存在着一些尚待解决的问题，使得实际应用受到限制。“自杀性”DNA疫苗是基于常规的DNA疫苗和自主复制型RNA疫苗而发展起来的一种新型疫苗。由于其制备原理和过程与常规DNA疫苗相类似，所以它具备常规DNA疫苗在制作、运输储存以及免疫等各方面的优点。同时由于它以甲病毒复制子为基础能诱导转染细胞自主凋亡，故比常规DNA疫苗更为安全有效。文章针对“自杀性”DNA疫苗载体的构建、作用机理、优点以及国内外研究情况作一介绍。
关键词：“自杀性”DNA疫苗；甲病毒；“自主复制型”RNA复制子
“自杀性”DNA疫苗(suicidal DNA vaccine)是以常规的DNA疫苗和自主复制型RNA疫苗(selfreplicating RNA vaccine)为基础发展起来的一种新的疫苗设计。与传统的核酸疫苗相比，“自杀性”DNA疫苗不但具有其制备简易、运输储存方便等优点，而且更为安全有效，较低剂量就能诱导出较好的免疫应答，并能突破机体的免疫耐受。因此，具有广阔的应用前景，近年来受到国内外越来越多疫苗领域研究者的关注。
1 “自杀性”DNA疫苗的构建及作用机理
1.1 “自主复制型”RNA复制子载体
“自杀性”DNA疫苗的载体是以甲病毒复制子(replicon)为基础的复制型DNA载体。甲病毒(Alphavirus)是披膜病毒科(Togavirus family)的成员，包括Semliki frost病毒(SFV)、Sindbis病毒(SIN)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)等。病毒基因组为单股正链RNA，长约12 kb。其5′端具有帽状结构，3′末端具有多聚腺苷酸序列。全基因组共有2个开放阅读框架。3′末端后1/3编码数种结构蛋白称为结构区，非结构蛋白基因的开放阅读框位于5′端2/3部分，编码病毒复制所必需的酶。此酶以正链RNA为模板合成负链RNA，后者在酶作用下合成全基因组RNA和亚基因组RNA(26S RNA)。翻译成3种病毒结构蛋白。亚基因组RNA既不作为RNA合成的模板，又不包装入病毒颗粒，且在病毒复制时结构基因拷贝数高达107～108之多。因此，可以利用亚基因组的启动子使外源基因获得高效表达。
构建甲病毒载体首先需将甲病毒基因组RNA转变成全长cDNA。目前已成功建立了SFV、SIN和VEE等的cDNA感染性克隆。1989年，Xiong等在SIN病毒感染性克隆Toto1000和Toto1002的基础上，首次成功的以SIN病毒为基础构建了一种高效的表达载体。1991年，Liljestrom把SFV的cDNA克隆pSP6SFV4结构基因和非结构基因分开，构建了SFV表达载体系统(图1)。
在RNA复制子载体系统中，启动子并不直接指导外源基因的表达，而是控制具有自主复制能力的甲病毒 RNA复制子的表达，甲病毒RNA可翻译产生病毒复制酶复合物，进而介导插入的外源基因在细胞浆内大量转录复制，使得外源基因编码的mRNA和蛋白获得高效表达。RNA复制子的大量复制可导致感染细胞的凋亡。该凋亡可能是复制型载体在表达外源基因的过程中产生双链RNA(dsRNA)复制中间体介入的结果。dsRNA是一种干扰素的有效诱导剂，它可激活2′～5′腺苷酸合成酶系统和双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)。2′～5′腺苷酸合成酶系统通过2′～5′腺苷酸的合成促进干扰素抗病毒效果和自身RNA酶的活化，以降解病毒和细胞的RNA；而激活后的PKR磷酸化NFκB抑制子IκB，使之与NFκB脱离，活化NFκB，诱导某些与凋亡相关的蛋白基因的转录，比如 p53、cMyc、Fas、Fas配体、caspase1等，最终引起宿主细胞发生凋亡。凋亡的细胞可被树突状细胞等其他抗原递呈细胞摄取吸收选择递呈免疫系统。同时，双链RNA中间体自身可产生很多的免疫刺激信号；双链RNA对树突状细胞的直接效应诱导其成熟活化，提高MHC分子的表达。这些作用类似于自然RNA病毒感染所激发的一系列宿主保护性免疫反应。此外，这种具有自我复制功能的RNA复制子还可诱导被转染细胞甚至邻近细胞产生热应激蛋白(HSP)免疫刺激因子；而且在体内自主合成的双链RNA本身可诱导干扰素(IFN)、PKR的产生。因此，dsRNA能在细胞和体液免疫中起强大的辅助作用。
目前，以这种“自主复制型”载体为基础的RNA疫苗已在流感病毒、人单纯疱疹病毒中进行了尝试，并证实疫苗不仅能诱导较强的体液免疫，而且能激发细胞免疫。
1.2 DNARNA载体
由于RNA复制子载体系统为原核启动子(SP6)，不利于体外操作(必须在体外将DNA转录成RNA)，用作疫苗保存及运输都不方便，且生产成本较高。因此，研究者尝试将该载体系统改造成以DNA为基础的、RNA
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删除 Guest (2008-6-03 17:56:12, 评分: 3 )