海南省畜牧兽医管理站， 海南 海口 570203
自1990年至2000年间，海南省部分市县某些村庄的耕牛零星发病，共死亡1 663头。海南省畜牧兽医管理站分别于1996年和1997年进行耕牛放养观察、尸体剖检、毒物检测、病毒和细菌分离等，结果在采集的23头病牛的样本中分离出致病力较强的A型、C型魏氏梭菌，从而证明牛“猝死”实为牛魏氏梭菌病。随后，我站与兰州兽医研究所联合研制牛魏氏梭菌多价苗，在6个疫点试用。经2年多的观察，疫点的牛魏氏梭菌病基本得到控制。
但在部分疫点仍存在牛发病死亡的现象。为了研究牛魏氏梭菌多价苗免疫后的抗体产生情况及对牛的保护率，给今后该病的免疫预防提供科学依据，并探讨免疫后仍有发病死亡的原因，我站进行牛魏氏梭菌多价苗的免疫试验。试验结果表明，17头免疫过的牛对牛魏氏梭菌多价苗免疫应答率达82.35%（14/17），抗体产生的合格率为35.29%（6/17）。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验牛 共78头牛。屯昌县坡尾村22头实验牛，由省畜牧兽医管理站从疫点外的农村购买，2～5岁，临床表现健康。自然放牧饲养，役牛照常使役。琼山市儒范村56头实验牛选自该村农户原饲养的健康牛。
1.2 疫苗 为中国农科院兰州兽医研究所生产的A、B、C、D型魏氏梭菌苗，每毫升疫苗分别含有10、10、20、10个抗原单位（致死小鼠毒素单位）。批号为0970922，每瓶100 ml，置5～
1.3 标准毒素及血清（抗毒素） 购自中国农科院兰州兽医研究所。标准毒素有C型和D型；标准血清有C型和D型。每瓶10 ml，置于4~6℃保存。
1.4 被检血清 采自屯昌县坡尾村的实验牛和灵山镇儒范村农户牛共19头份，其中非免疫牛血清2份，供对照用。
1.5 小鼠 购自海南实验动物饲养中心（实验动物管理委员会），每只体重19~
1.6 试验方法及步骤 （1）成牛每头肌肉注射5 ml。坡尾村免疫注射18头，4头注射生理盐水做对照；儒范村56头牛全部免疫注射。免疫后48~69日采血分离血清待检。（2）取C、D型标准牛魏氏梭菌毒素各0.1 ml,置于灭菌的西林瓶中,分别加生理盐水4.9 ml,作1∶50倍稀释。将小鼠分成C型毒素组、D型毒素组和空白对照组，每组6只。分别取C、D型的毒素稀释液和生理盐水，用0.1 ml，0.2 ml，0.3 ml剂量，尾静脉注射。
每种毒素以同样的剂量注射2只小鼠。能在4 h内致死小鼠的毒素效价量为1个致死单位。根据所测出的效价，用生理盐水把分别将C、D型毒素稀释成0.1 ml中含1个致死单位的毒素液体。（3）免疫的牛血清中含有一定量的抗体（抗毒素），产生的抗体越多，对牛魏氏梭菌病的抵抗力越强。按羊的梭菌病免疫抗体水平测定，每毫升血清中至少含有能中和5~8个小鼠致死单位，才能抵御牛魏氏梭菌毒素的攻击。根据牛魏氏梭菌苗免疫原理，设计以毒素与抗体为中和反应的体外实验模型。（4）每份牛血清吸出0.5 ml，加到两个灭菌的西林瓶中。将稀释好的C、D型毒素0.5 ml分别加到含血清的西林瓶中（每瓶加入相当于5个致死单位的毒素）。此时的西林瓶子中应有1 ml的混合液。另以生理盐水代血清，照上述方法加入毒素稀释液做对照组。（5）将西林瓶中的含混合液混匀后置于37℃温箱中作用60 min。（6）抽取西林瓶中混合液，在小鼠尾静脉注射，每瓶注射2只，每只0.4 ml。做好记号，观察发作症状及死亡情况。
2 结果
2.1 两个试验点，共免疫注射78头。注射后3日左右个别牛的注射局部出现肿胀，食欲
略下降，体温升至38℃，2～4日后恢复正常。未见免疫应激或免疫造成的死亡现象。
2.2 经牛魏氏梭苗C、D型标准毒素效价测定，稀释后的两种毒素最小致死量均为0.1 ml。生理盐水对照组的6只小鼠全部存活。
2.3 17头免疫牛的魏氏梭菌抗体检测，能起保护作用的有6头份，能起部分保护作用的8头份，完全不能保护的3头份。
2.4 对照组2头份牛血清抗体测定的4只小鼠全部死亡，最快死亡时间为5 min，最慢的220 min。
3 小结及分析
3.1 标准毒素效价测定表明，D型毒素比C型毒素对小鼠的致死作用快，产生的抗体保护
率也比C型毒素高。
3.2 牛魏氏梭菌多价苗按规定剂量肌肉注射或皮下注射比较安全的，副作用小，未见有严重反应或死亡牛现象。
3.3 检测17头份牛血清，C、D型免疫抗体达到保护水平的35.29%，具有部分保护水平的47.05%，完全无抗体的17.64%。其中屯昌坡尾村的牛抗体总体水平较高。说明牛魏氏梭菌多价苗的免疫保护率不太高，按试验结果测算，综合保护率约50%～60%。
3.4 部分牛抗体水平低，不能抵御毒素的攻击是造成牛魏氏梭菌病仍然发生的原因。建议今后在疫点要坚持每年2次的免疫注射，以巩固和提高抗体水平。另外应加大疫苗的抗原单位和注意疫苗的佐剂的选择，提高抗体水平，减少对注射部位的刺激。
3.5 根据血清中抗体检测表明，部分免疫牛的抗体水平较低或未能检出抗体，这是免疫后仍有牛发病死亡的主要原因。
3.6 牛魏氏梭菌病多见健壮的成年牛，且发病的机理较复杂，不但需要气候的变化，而且还要改变消化道的微生物群结构。包括中国农科院兰州兽医研究所在内的吉林、广西都未能用口服的方法人工发病，故不能进行人工保护试验。
